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1.
Amber samples from various origins
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ZHANG Zhiqing, Andy Hsitien Shen. Analysis of Amber Components by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry[J]. Journal of Gems & Gemmology, 2022, 24(4): 1-9. DOI: 10.15964/j.cnki.027jgg.2022.04.001
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琥珀是一种常温常压下物理化学性质较稳定的化石树脂。由数十百万年到数亿年前(从距今约320百万年石炭纪[1]至距今约17百万年中新世中期)的松柏科植物、被子植物渗出或未渗出的新鲜树脂，经过固化、交联聚合、挥发份挥发而逐渐形成。琥珀的物质组成复杂，但随着质谱等技术的发展，逐渐有了一系列重大突破。王雅玫等[2]通过元素分析仪测定了不同产地琥珀及柯巴树脂中总碳、氢、氧的质量分数变化规律。琥珀物质成分被分为非挥发性组分和挥发性组分。20世纪90年代，Anderson等[3, 4]借助热裂解-气相色谱-质谱(Py-GC/MS)研究化石树脂，确定了480 ℃的最佳热解温度和化石树脂中的非挥发性大分子骨架结构，并基于化学成分开创性地提出了延用至今的化石树脂分类体系，后Poulin和Helwig等[5]，Wang等[6]学者进一步补充。相对而言，挥发性成分的分子量低、含量少、可溶解在合适溶剂中，从而易与于实现后续分馏、纯化、结构测定等化学分析，如程松等[7]采用水蒸气蒸馏法提取琥珀挥发性组分，用气相色谱质谱(GC-MS)鉴定出琥珀中49种化合物; Otto等[8]和Simoneit等[9]对比分析了不同植物源琥珀中的挥发性组分种类与植物科属的对应关系。
常用的GC-MS技术以高能电子电离(EI)方式将待测物电离成碎片离子，根据总离子流图(TIC)保留时间和离子碎片质谱与美国国家标准与技术研究所数据库(NIST)比对匹配出相似物，但无法直接获取物质的相对分子量信息。1987年，诺贝尔获得者Karas和Hillenkamp[10, 11]发现了有机物在激光辐照过程中可形成分子离子的特性。这种软电离技术使分子失去电子生成带电分子离子而不会碎裂，保有待测分子的相对分子质量信息[10, 11]。基于软电离技术的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)具有所需样本量少，样品制备简便，离子源所产生的分子离子碎片率较低，保留了待测物的完整信息，检测灵敏度高等优点，因此，已在蛋白质、微生物、石油化工等大分子有机物检测中得到广泛应用，但在小分子检测方面需有效的辅助基质来吸收激光能量传递给待测分子并使其从表面解吸，从而使中性待测分子带电[12-16]。Tonidandel等[17]曾尝试用软电离技术(激光解吸电离飞行时间质谱，即LDI-TOF-MS)直接分析不同产地和年代的琥珀固体和二氯甲烷/乙醚(体积比=1∶1)混合溶剂提取物的质谱信息，证实了软电离技术对琥珀分析的可行性。随后又采用类似的软电离技术——电喷雾离子法[18]对波罗的海琥珀中琥珀酸定量测定，发现负离子模式下才能检测到琥珀酸离子峰[M-H]-：m/z=117。
为解决琥珀成分复杂且不均匀，溶解、萃取、纯化过程易引入其他有机物干扰，对分析结果造成影响的问题，笔者在前人尝试LDI-TOF-MS的基础上引入纳米尺度的碳膜作为辅助基质，采用MALDI-TOF-MS在原位上测试不同产地(波罗的海地区、缅甸、多米尼加共和国、墨西哥和中国抚顺)琥珀成分的相对分子量分布特征，为实现原位解析琥珀化学成分提供一种新角度。
将波罗的海琥珀(样品B-1~B-3)、多米尼加共和国琥珀(样品D-1~D-3)、墨西哥琥珀(样品MO-1~MO-3)、抚顺琥珀(样品F-1~F-3)、缅甸琥珀(样品M-1~M-3、样品MY-1~MY-3)切割成薄片并双面平行抛光，如图 1。
传统有机基质芥子酸、DHB(2, 5-dihydroxybenzoic acid)和CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)等在m/z 500以下有大量的本体峰干扰小分子检测，同时，纳米尺度的各类碳基底辅助基质在MALDI中被广泛尝试应用[18]。本文在中国地质大学(武汉)全球大地构造中心采用低真空镀膜仪(型号：Leica EM ACE200)，以脉冲式碳丝蒸发法对样本薄片进行镀碳膜，镀膜厚度约14.2 ~19.6 nm。碳膜良好的导电性可避免样品表面因电荷聚集干扰质谱测试结果[19-20]。
激光解吸电离飞行时间质谱在南京大学配位化学国家重点实验室完成，使用Bruker Ultraflex Ⅱ和Bruker ultrafleXtreme型基质辅助激光解析飞行时间质谱质谱仪，均配备337 nm氮气激光器。考虑到过高的激光强度会引起m/z=12的C干扰峰[16]，设置激光强度为60%，脉冲频率25 Hz，在正离子反射模式下多位点采集m/z=60~3 000质谱，对同一样品多次采集的质谱求平均质谱。
由于每次采集信号会消耗表面物质导致碳膜厚度逐渐变薄，通过多次采集同一样本、同一位点的质谱发现，随着测试次数的增加，主要质谱峰位几乎不变(图 2a)，信号强度随着碳膜的减少而降低(图 2b)，甚至部分弱峰无法检测到，说明碳膜可以有效增强质谱信号。
所有样品的主要质谱峰出现在低、中分子量m/z=60~800范围内。由于琥珀成分的不均匀性，同一样本上的有些测试点检测到了高分子量m/z=900~1 900的一系列间距为Δm/z=16的峰。细分m/z=60~800区间为A区(m/z=60~250)，B区(m/z=250~650)和C区(m/z=650~800), 并进行分析, 峰位描述按峰强递减排列。
波罗的海琥珀样品的MALDI-TOF-MS谱测试结果(图 3)显示：A区谱峰m/z=132、120、104、84、88、96、108、113、124、140、144、168、180; B区谱峰m/z=410、394、366、350、454、438、499、483、543、527，强度较A区弱; C区有一组明显峰m/z=687和703;B、C区谱峰间距均为Δm/z=16。
多米尼加琥珀样品的MALDI-TOF-MS谱测试结果(图 4)显示，A区m/z在132、120、104、108、84、88、96、113、144、151、168、180、197、214处存在峰位; B区谱峰少(甚至样品D-3未检出峰)且强度低，峰位位于m/z=410、394、366、350、360、344、499、484、543、527、297处; 仅样品D-1和样品D-2在C区检测到位于m/z=687和703的峰位。和波罗的海琥珀类似，多米尼加琥珀样品在B、C区内质谱峰间隔Δm/z=16。
墨西哥琥珀样品的MALDI-TOF-MS谱测试结果(图 5)显示，A区在m/z=132、120、124、108、104、113、84、88、96、140、144、168、181处存在峰位; B区谱峰较弱，位于m/z=269、285、296、313、341、369、378、410、439、456、483、499、543、587处，峰间距特征不明显; C区也有间隔Δm/z=16的强峰(m/z=687和703)。
中国抚顺琥珀样品的MALDI-TOF-MS谱测试结果(图 6)显示，A区在m/z=132、120、113、108、124、104、97、88、84、140、144、168、180、198处存在峰位; B区峰少且弱，位于m/z=296、410、353、368处; C区存在m/z=687和703处峰位，但强度不大。
缅甸琥珀样品的MALDI-TOF-MS谱测试结果(图 7)显示，A区峰相对较少，位于m/z=132、120、113、108、104、97、88、84、144、168、180、198处; B区存在弱峰，位于m/z=297、268、284、366、394、410、456、499处; C区也存在位于m/z=687和703处的峰位。
测试结果(图 3-图 7)反映出在正离子模式下，各产地琥珀在A区的质谱比在B、C区要复杂的多，表明原始样品的低分子量组分更易形成正分子离子[M+H]+。化石树脂的挥发性部分主要由单萜、倍半萜和一些二萜组成，而非挥发性部分由不饱和羧基二萜类酸组成，有时包含三萜类酸[8, 21](C30H48On，相对分子量> 408 Da)，结合程松等[7]鉴定出的化合物分子量均小于230 Da和Anderson化石树脂分类体系[3]指出琥珀的非挥发性骨架结构单元为二萜类酸(C20H32On，相对分子量> 272 Da)的结论，推测A区多为琥珀中的挥发性小分子，B、C区质谱峰则可能与挥发性二萜或非挥发性聚合物相关。
与Tonidandel等[17]用强度为95%的337 nm氮气激光电离测得波罗的海、墨西哥和多米尼加琥珀的质谱不同，本文中大多数样品在A区强质谱峰为m/z=132、120，质谱峰信号清晰且有一定相似度。虽然各产地琥珀的挥发性物质种类丰富且差异明显[22]，但在基质辅助下，各产地琥珀能被原位正离子化的挥发性组分种类类似。波罗的海琥珀样品中未检测到琥珀酸(C4H6O4，118 Da)的正离子峰m/z=119，说明MALDI-TOF-MS正离子模式也不适合琥珀酸的观察。
对比5个产地琥珀在B区的质谱峰发现，波罗的海、多米尼加和墨西哥琥珀比抚顺和缅甸琥珀峰位更丰富; 在C区，各产地样品的质谱峰恒定在m/z=687和703，但波罗的海和墨西哥琥珀中这两峰的相对强度明显高于其他产地。随着琥珀成熟度的增加(波罗的海琥珀 < 多米尼加琥珀≈墨西哥琥珀 < 抚顺琥珀 < 缅甸琥珀)，低、中分子量组分种类减少，进一步论证了当琥珀越成熟，非挥发性物质聚合程度越高时，其中能被激光解吸电离的组分减少的结论[17]。
各产地琥珀在B区的质谱峰间隔规律性明显，尤其是波罗的海琥珀样品B-2中峰m/z=366、410、454、499和543，均相差Δm/z=44，与CO2相对分子质量相当，参考Tonidandel等[18]研究琥珀酸的思路，这些物质之间可能损失了CO2而形成这一系列峰。同时，位于m/z=350、394、438、438和527的峰位与前述5个峰间隔约为Δm/z=16，峰m/z=687和703间距也类似，与一个氧原子相对原子质量相当，推测相邻两峰所指示的物质C数目一致，仅有1个氧原子的区别。相似的特征在更高分子量m/z 900~1 900内也有出现(图 8)，在波罗的海、墨西哥、中国抚顺和缅甸琥珀中，峰位于m/z=1 138、1 154、1 211、1 230、1 286、1 302、1 362、1 378、1 436、1 452、1 510、1 526、1 584、1 600、1 659、1 675、1 733、1 749、1 807、1 823、1 881和1 896处近乎等距分布，间距Δm/z约为16和74，分别与一个氧原子相对原子质量和一个乙酸分子质量相近。但仅多米尼加和抚顺琥珀在m/z=929、945、1 002、1 019、1 063和1 079有较弱的质谱峰。推测这些高分子量质谱峰可能也与琥珀骨架结构单元形成的聚合物的热解产物有关[17]。
琥珀与空气长期接触，会发生缓慢氧化作用，通过对氧化程度由外至内逐渐减弱(测试位点编号1~15)的缅甸翳珀进行测试对比分析(图 9)发现，高分子量区m/z=900~1 900一直未检测到离子信号，而随着氧化程度增加，低分子量区m/z=100~200分子丰度减少，中分子量区m/z= 250~800分子丰度增加，说明在分子聚合程度更高的翳珀中，高分子量组分不易被电离; 低、中分子量组分含量受氧化程度影响，氧化作用会使低分子量组分种类和丰度减少，而中分子量组分增加。
通过碳膜辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪原位分析琥珀成分得到以下结论。
(1) 激光解吸电离作为一种典型的软电离技术可以应用于琥珀成分研究中，碳膜作为辅助基质时有利于增强质谱信号。
(2) 质荷比(m/z)在60~250、250~800和900~1 900区间内的物质分别与琥珀中的低、中和高分子量组分相关，低分子量组分比中、高分子量组分更易被电离成正分子离子。
(3) 各产地琥珀中能被电离成正离子的物质相对分子量相似，但在非挥发性物质聚合程度更高的抚顺、缅甸琥珀中，能被有效电离的组分更少。
(4) 氧化作用促使低分子量组分减少，而中分子量组分有增加趋势。
虽然MALDI-TOF-MS为原位分析琥珀物质组成的相对分子量分布特征提供了一种途径，但由于琥珀成分的不均匀性和复杂、未知性使得仅凭此方法仍无法确定分子的具体化学式和立体结构，仍需在未来工作中联用化学分析技术进行深入探索和确证。
南京大学化学化工学院耿志荣博士对本文MALDI-TOF-MS实验进行了指导和建议，在此表示感谢！
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