A Review on Pretreatment Method for the Analysis of Complex Chemical Composition of Resinite
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摘要: 树脂化石复杂有机组分的分离检测及解析一直是树脂化石研究中的热点和难点，早期前处理方法和一维气相色谱-质谱的分离分析效率有限，挥发性组分数据易丢失，峰重叠现象严重，很难对其化学组成进行准确鉴定。本文对比分析了4种前处理方法(溶剂萃取、化学衍生化、热裂解和固相微萃取)在树脂化石前处理中的适用范围和优缺点。(1)溶剂萃取法适用于分析树脂化石中倍半萜类、三萜类、酚类、饱和烃、芳烃等物质，但石化程度高的琥珀所需溶解时间长且不能完全溶解，不适用此方法，石化程度低的柯巴树脂更适用于此方法。(2)化学衍生化法适用于定性分析基团中有活泼氢的分子，衍生化后可有效改善相关分子的挥发性、稳定性和增强响应信号强度。(3)热裂解法主要针对树脂化石有机聚合物的主要骨架，但是以裂解碎片还原初始结构会存在一定偏差。(4)固相微萃取法适用于树脂化石中的挥发份/半挥发份的分析，但易出现检出物不完全的情况。结合顶空高容量固相萃取法和直接热脱附法样品前处理技术和全二维气相色谱-质谱技术，可检测到传统分析方法3~4倍的化合物种类数量, 并通过非靶向代谢组学策略分析不同产地树脂化石色谱质谱结果，可筛查出更具代表性的特征化学信息，研究复杂有机组分的分离、同分异构物的准确判别，解决固相复杂有机组分检测解析的突出难题，在挥发性-半挥发性有机组分分离及二次富集、高特异性生物标志物筛选方面高效解析，为树脂化石在其古生态环境复原及成熟演化过程探究奠定理论和技术基础。Abstract: The separation, detection, and analysis of complex organic compositions in fossil resin have always been a hot and difficult point in the research. The early sample pretreatment methods and the separation and analysis efficiency of one-dimensional gas chromatography-mass spectrometry (1D GC-MS) were limited, overlapping spectral peaks and missing mass spectra peaks of trace substances easily occurred in the chromatography-mass spectrometry analysis, .Hence, it was difficult to accurately identify its chemical compositions. In this review, it systematically summarizes the application, advantages, and disadvantages of four pretreatment methods (solvent extraction, chemical derivatization, pyrolysis, and solid phase microextraction) used in the compositions analysis of resinites. (1)Solvent extraction is suitable for the analysis of sesquiterpenes, triterpenes, phenols, saturated hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, and other substances in the resin fossils. However, amber with high degree of petrifaction requires a long time to dissolve and cannot be completely dissolved, hence, solvent extraction is much more applicable to copal with lower degree rather than highly fossilized amber. (2)Chemical derivatization is applicable to qualitative analysis of molecules with active hydrogen in the group, which can effectively improve the volatility and stability of related molecules and enhance the response signal intensity after derivatization. (3)Thermal pyrolysis mainly aims at the analysis of the main macromolecular skeleton of the resinite, but there will be some deviation in the reduction of the initial structure by the pyrolysates. (4)Solid phase microextraction is suitable for the analysis of volatile/semi-volatile components in amber, but it is prone to incomplete detection. The sample pretreatment technologies of headspace high-capacity solid phase microextraction and direct thermal desorption combining with comprehensive two-dimensional gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS) were creatively proposed, which could detect 3-4 times as many compounds number as the traditional analysis method. More representative biomarkers can be screened by untargeted metabolomics strategies to analyze the GC-MS results of resinites from different habitats. Our team will focus on the isolation of complex organic components and the accurate identification of isomers, and reveal the origin of ancient plants and genesis of resin fossils of different origins and ages. It is expected to solve the outstanding problems in the detection and analysis of complex organic components in the solid phase, and efficiently analyze volatile and semi volatile organic compounds in terms of separation, secondary enrichment, and screening of highly specific biomarkers, which provides a theoretical and technical foundation for the exploration of reconstruction of their palaeoecological environment and maturation evolution.
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Keywords:
- resinite /
- amber /
- solvent extraction /
- chemical derivatization /
- pyrolysis /
- solid phase microextraction
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1. 树脂化石概述
树脂化石(柯巴树脂和琥珀)是由不同地质时期(主要是白垩纪晚期-新近纪中新世)古植物分泌的树脂经数千万年乃至上亿年地质作用形成的化石类型，属典型的多组分有机大分子聚合物，其化学成分具良好的保存性和成熟度继承性。然而，树脂化石的组成非常复杂，传统的光谱学测试难以探知其具体成分，早期的样品前处理方法(如有机溶剂的溶解、索氏抽提、旋转蒸发等)和一维气相色谱-质谱(1D GC-MS)的分离分析效率有限[1]。上述前处理方法存在操作繁琐，过程耗时长，有机试剂耗费量大，污染环境等问题，甚至对挥发组分易导致某些数据的丢失，且1D GC-MS的峰容量和分辨率较低，峰重叠现象严重，在色谱图上常出现一系列共流出峰，阻碍了其有机组分的全面准确解析[2]。因此，复杂的有机组分分离检测及解析一直是树脂化石研究中的热点和难点。树脂化石是地质时期古环境和古气候特有记录，不仅可以利用其稳定的碳、氢同位素重建古大气氧气分压的情况[3-4]，也能对古植物及其与周边环境的相互作用关系进行还原[5-6]，充分认识各类树脂化石的化学成分对于了解古植物并还原古植物栖息环境有重要意义。树脂化石的分类庞杂、产地众多、形成时间跨度长[7]以及初始树脂种类和沉积形成环境不同，致使其成分和结构非常复杂且差异较大，包括挥发性成分、半挥发性成分及难挥发性成分，如何使这些成分有效分离、充分检测及准确鉴定是学界急需解决的难题。
树脂化石中的琥珀是人们喜爱的珍贵有机宝石，它作为珍贵的文物遗存记载着古代欧洲“琥珀之路”和中国“丝绸之路”沿途东西方文化交流的信息，是人类悠久历史和伟大文明活动的物质载体，携带着古代社会、历史、艺术以及科技等诸多信息。琥珀的成分解析为揭示树脂化石的复杂有机组分提供了可能，对于其成熟度演化过程示踪、古植物溯源与高等植物演化、古环境气候变化及产源分析具有重要意义。在树脂不断成熟过程中，通过异构化作用其保留的原始基本骨架，形成具有特异碳骨架结构的生物标志物[8]。K.B.Anderson等[9]在1992年根据树脂化石中主要有机成分的结构表征特点，将其划分为五个类别(I -V类)，市场上常见的琥珀主要属于Ⅰ型树脂化石，主要由半日花烷型二萜聚合物构成，单体在其中交联形成网状结构，因而质地坚硬，化学稳定性(图 1)。
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图 1 Ⅰ型树脂化石的基本结构及其单体结构示意图[9]Figure 1. The basic structure of ClassⅠ resinites and its monomeric structure前人对于树脂化石的前处理方法有溶剂萃取、化学衍生化、热裂解和固相微萃取[8-33]，对琥珀中的萜类、芳香烃类成分也有较多探讨[10-12]，但仍有许多成分还未得到有效解析。在宝石学领域，琥珀的研究主要集中在其官能团或粗提物的谱学特征表征与分析[13-14]。琥珀的化学分析流程和常见的前处理方法如图 2所示，在其组分分析过程中，可能会出现与目标组分性质相似的干扰成分，导致与被测组分的峰分离不完全或者出峰时间接近而无法判断，前处理可以减少杂质干扰、改善分离效果；有些目标组分的含量过低，远远低于色谱仪/质谱仪的检出限，无法准确测得目标物含量，需要通过提取、富集、浓缩等预处理方法提高检测的灵敏度。由于前处理的步骤繁杂，方法不得当或者忽略某一操作，会使加标回收率偏低，目标物质定性错误，结果出现偏离，所以有效前处理是化学分析中重要的一环。
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图 2 树脂化石化学分析流程和常见的前处理方法Figure 2. The chemical analytical workflow and common pretreatment methods for resinites图 2和表 1针对树脂化石(柯巴树脂和琥珀) 化学分析中的前处理的难点问题进行了总结和探讨[8-33]，包括能够有效分离不同特性琥珀成分的溶剂萃取、化学衍生化、热裂解和固相微萃取，这些前处理方法主要面向气相/液相色谱质谱的后续分析。在本文，结合笔者实际测试中的结果与经验，提出了不同前处理方法的优缺点，首次归纳了不同研究目标适用的前处理方法，为后续琥珀复杂组分的高灵敏度、高精确分离分析方案提供了参考，有望以琥珀为载体，为宝石学、考古学、地球化学等领域增加更多有意义的论据。
表 1 前处理方法文献总结Table 1. Summary of literatures on resinites pretreatment methods
2. 溶剂萃取-气相色谱-质谱在琥珀成分分析中的应用
溶剂萃取是色谱质谱前处理中最常用的方法之一(图 3)，是一种利用物质在不同溶剂中溶解度或分配系数的不同，使可溶物质转移到溶解度较大的溶剂中的物理方法。该方法除了最基础的单一溶剂萃取外，在实际应用中，也常通过两种或以上互不相溶(或微溶)的溶剂对可溶物质进行分离和富集。部分溶质萃取液可直接连接液相色谱或气相色谱的进样端，并且多数操作在室温下完成，待测萃取液性质稳定。该方法的主要优势操作便捷，可实现待测复杂物质的分离富集，提高检测准确性和针对性。
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图 3 样品制备与组分分离的基础步骤Figure 3. Basic steps in sample preparation and component separation单一溶剂一般适用于提取理化性质相同或相似的成分，不同溶剂对琥珀的溶解效果如表 2。而琥珀的成分较为复杂，为了更好适应后续色谱分析，常采用混合溶剂提取极性覆盖面广的溶质。在琥珀溶剂萃取前处理中，最常采用的是一定配比的二氯甲烷和甲醇作为溶剂。二氯甲烷的沸点较低，适用于后续的气相色谱分析[40]，而甲醇的分散和渗透能力较强。Salván等[17]发现了琥珀中的成岩产物(酚类萜类化合物和海松酸)及与拟节柏属植物来源相关的生物标志物(萜类化合物); Mallick等[18]证明倍半萜类化合物比五环三萜类化合物更容易受到成岩作用的影响; Wang等[20]改进了前处理技术和分析方法，利用柱色谱法联立一维和二维核磁共振波谱(COSY、HMBC、ROESY)，对具有蓝色荧光的多米尼加琥珀中可溶组分开展了精细的化学组分解析，首次报道了15-降-克罗-(3, 12)二烯(15-nor-cleroda-3, 12-diene)是多米尼加琥珀的生物标志物。在化学成分分析上虽取得了很大的进步，但树脂化石成分极其复杂，存在挥发性、极性、和可溶性相差较大的各种组分，针对各种性质组分的有效分离方法需要进一步探究；并且其成分中含有大量同分异构物，如何区分并准确鉴定其成分结构是有待攻克的一个难题。
表 2 琥珀与不同溶剂(含化学式)的反应时间和效果[41]Table 2. Chemical reaction of the amber to different solvents, their chemical formula, and the duration of the reaction[9]溶剂 化学式 时间 效果 Acetone C3H6O ∞ 在丙酮中浸泡了几天后，琥珀仅有表面受到了影响，琥珀样品变得很脆且碎 Dichlormethane CH2Cl2 ~1 h 琥珀在二氯甲烷中快速溶解了，但溶剂对包裹体是否有影响还未进行检测 Trichlormethane CHCl3 ~0.5 h 琥珀快速地褪色并且溶解，并且琥珀内部的包裹体脱水 Dimethylformamide HCO-N(CH3)2 ∞ 琥珀样品仅漂浮在溶剂表面，几周后都没有变化 Formaldehyde CH2O ∞ 琥珀样品仅漂浮在溶剂表面，几周后都没有变化 Petroleum ether CnH2n+2(n=5~8) ∞ 石油醚具有多个闪点，使琥珀具有弹性且变得不透明; 此外，石油醚还浸渍了样品, 琥珀开始产生线状条纹; 几个小时后，浸泡在石油醚中的琥珀变成了泥土状、粘稠的混合物 Turpentine oil predominantly C10H16 (α-Pinen) ~2 d 溶解琥珀的时间最长，但溶解的效果很好; 溶剂对包裹体是否有影响还未进行检测 Orange oil predominantly C10H16 (d-limonene) 3~4 h 溶解琥珀的能力很强，至今为止没有发现橙油会损坏包裹体 Toluene C6H5CH3 ~1 h 溶解琥珀的能力很强，与少量的乙醇混合时效果最好；包裹体残留在溶剂中时会脱水 Xylene C6H4(CH3)2 ~1 h 比甲苯溶解琥珀的效果更强; 溶剂对包裹体是否有影响还未进行检测 经过溶剂萃取的琥珀可溶物中通常包含极性化合物、饱和烃和芳烃[19]，其中倍半萜类与三萜类物质与形成琥珀的古植物分泌的树脂关系紧密，常作为生物标志物追溯琥珀的古植物源[41]。例如，花侧柏烯与柏科或杉科有关[42]，α-Amyrin和β-amyrin与乌桕有关[43]。然而琥珀的溶解性与石化程度紧密相关，形成年代越久、石化程度越高的琥珀中可溶性成分越少。因此，多采用溶剂萃取法前处理的多为形成年代较近的琥珀，如多米尼加琥珀、波罗的海琥珀、墨西哥琥珀等(始新世-中新世)，而对于形成年代早的琥珀，如缅甸琥珀、抚顺琥珀(白垩世)较不适用。在实际测试中，笔者也发现相比于年代较近的多米尼加琥珀，缅甸琥珀的溶解物质非常少，石化程度高的琥珀需要寻求其他前处理方法。图 4展示的高效液相色谱-紫外检测结果分别为多米尼加琥珀(图 4a)和缅甸琥珀(图 4b)，多米尼加琥珀的响应信号强度明显强于缅甸琥珀。
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图 4 缅甸琥珀(a)和多米尼加琥珀(b)的高效液相色谱-紫外检测结果Figure 4. HPLC chromatograms of amber from Myanmar (a) and amber from Dominican Republic (b)3. 化学衍生化萃取-气相色谱-质谱在琥珀成分分析中的应用
琥珀中含有大量醇类、酸类有机极性化合物，由于其沸点较高，在GC-MS分析时难以气化，需要对其进行衍生化处理。衍生化反应一般是通过待测组分分子结构(如R-OH、R-COOH、R-NH2、R-SH)中的活泼氢与相应的衍生化试剂反应生成衍生物，达到降低极性化合物的沸点，改善被测组分的挥发性、增强响应信号强度等，为色谱分离和质谱定性定量检测带来良好效果。常用的方法有硅烷化、酰化、烷基化等[44]。
衍生化法一般分为柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生是指将检测组分先通过衍生化反应，转化为衍生化产物，然后再经过色谱柱进行分离。这种衍生化方法是靠与带有发色基团或电化学活性基团的衍生化试剂反应，使本来不能被检测的组分被检测出来，被测组分与衍生化试剂有选择地参与反应，而与样品的其他组分分离开，或者改变被测组分在色谱柱上的出峰顺序，使之有利于分离；柱后衍生是分离物在分析柱中实现分离后，在衍生池内与衍生剂反应，在柱子中分离的是目的物，在检测器处检测的衍生产物。对琥珀的化学成分检测一般使用柱前衍生，即将样品研磨、称重、转移至石英试管后，先TMAH或HMDS等衍生化试剂混合发生衍生化反应，而后对试管内的混合物进行热解气相色谱质谱等检测分析(图 5)。
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图 5 化学衍生化法分离组分的步骤Figure 5. Steps for the separation of components by chemical derivatization琥珀的结构中多存在羟基、羧基和酯基，因此琥珀分析较常用的衍生化方法是热辅助水解甲基化(Thermally Assisted Hydrolysis, Methylation, THM)[28, 45]和硅烷化[21, 24, 46]。THM反应包括酯键和醚键经高温水解形成季铵盐和季铵盐裂解生成的烷基化产物两个步骤，其中，四甲基氢氧化铵(TMAH)是琥珀甲基化中最常用的试剂，也是甲基化试剂中碱性最强的，它能将羟基、羧基、氨基衍生化。Decq等[28]采用THM-GC-MS对马尼拉、桑达拉克、南美和刚果柯巴进行了分析，运用代谢组学分析方法可有效甄别出这4个产地来源的生物标志物。
相比于甲基化反应中强碱性的四甲基氢氧化铵(TMAH)，硅烷化中相对温和的试剂六甲基二硅烷(Hexamethyldisilane, HMDS)逐渐为部分学者所用，硅基化能有效降低化合物的极性以及氢键数量，且比硅基化衍生物更容易挥发、更稳定，被检测能力得到增强(图 6)。Poulin等[24]利用HMDS硅烷化结合热裂解对来自加拿大3个不同矿床的琥珀进行了分析，有效鉴别了其中的琥珀酸，结合半日花烷型二萜单体结构，论证了Id型琥珀的存在。Laura[21]采用热裂解-气相色谱-质谱联用技术(Py-GC-MS)对艺术作品中二萜树脂的组成进行了测定，采用HMDS作为衍生试剂，提高了检测灵敏度，并提高了最具代表性峰的分辨率。该方法减少了热解过程中形成的裂解产物、重组产物、脱水产物和异构产物的数量，得到更简化的色谱图。
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图 6 相对于TMAH甲基化反应，HMDS硅烷化反应具有更高的灵敏度和最佳峰值分辨率[21]Figure 6. The higher sensitivity and a best resolution of peaks achieved from the derivatization with HMDS, compared to the TMAH methylation reaction然而，这两种衍生化试剂都有一定局限性。TMAH衍生化反应的结果与溶剂的选择和反应温度密切相关，过量的TMAH添加和过高的反应温度甚至可能发生产物的异构化，这使得它在定量分析中较不适用[47]。而当TMAH用于甲基化含酮萜酸时，还可产生甲基化烯醇互变异构体而可以形成额外的色谱峰[48]。HMDS硅烷化在不当实验条件时易导致反应后的色谱峰明显增多，是由于HMDS在将许多热解产物转化为挥发性分子的同时，也诱导了更多分子的碎片化。此外，衍生化反应中的脱羧和部分硅基化的情况也进一步增加了热解产物的数量[49]。
4. 热裂解-气相色谱-质谱在琥珀成分分析中的应用
热裂解前处理主要针对高分子聚合物等材料，它通过高温(400~900 ℃)瞬间裂解的方式，将高聚物裂解为碎片，生成分子量低而挥发性高的分子。热裂解通常联合气相色谱质谱使用，载气将裂解分子导入色谱质谱GCMS仪器中，获取裂解产物色谱图，通过色谱图上各碎片峰的质谱图分析，推导分析碎片产物的来源，进而完成高聚物的分子结构判定[50]。热裂解-气相色谱-质谱(Py-GC-MS)原理图如图 7。
由于琥珀的主要成分难溶，且其为交联大分子有机物难以挥发，因此热裂解-气相色谱-质谱便成了琥珀全组分分析的有效方法。由于热裂解处理时材料中的活泼氢基团容易被破坏，故常采用烷基化或硅烷化的衍生化反应，以保证结果的准确性。琥珀的分类是根据骨架大分子结构形式以及琥珀酸的含量而确定的，而热裂解是目前最有力的分析高聚物的前处理方法，因此琥珀的分类分析和大分子结构确定几乎有赖于热裂解的前处理方式。Werf[27]采用热裂解-气相色谱-质谱测定了西西里琥珀的整体化学成分。结果表明，西西里琥珀的聚合物部分为聚合的半日花烷型二萜结构，具有对映体构型。此外，琥珀酸含量极低。因此该琥珀属于Ic类，起源于豆科植物。Poulin [26]采用HDMS衍生化处理结合热裂解对波罗的海Ia类琥珀和加拿大Id类琥珀进行了分析，确认了其中聚合半日花烷型二萜单体的构型，并且确认了琥珀酸在这两种琥珀结构中的作用。
在前处理方法中，热裂解是样品量需要最少(微损，微克量级)而分析结果最为全面的方法。该方法常作为珍贵出土琥珀的前处理方法，对于其产地溯源有重要意义。Colombini等[22]利用热裂解-气相色谱-质谱及红外光谱对俄罗斯、波兰等博物馆所藏的20块琥珀藏品进行了产地来源和降解机制研究，这些琥珀藏品来自波罗的海，外层多孔粗糙的外观可能与较高的浸出率和游离二萜从表面蒸发有关。Park等[30]采用热裂解-气相色谱-质谱对朝鲜半岛六世纪慕容国王陵墓中出土的琥珀文物进行了分析，在一些样品中观察到波罗的海琥珀的典型成分小茴香醇、樟脑、冰片和丁二酸，继而确认琥珀来自波罗的海。此外，热裂解对于出土样品的琥珀近似材质区分也非常准确。Kaal等[51]采用热裂解结合衍生化反应联合气相色谱质谱对巴拿马地区出土的树脂雕像、黄金制品的充填物、现代树脂及琥珀进行了分析，通过二萜成分的确认，判定出土树脂类样品由孪叶豆属的树脂组成，其树脂聚合度高于现代豆科植物树脂但成岩作用远小于琥珀，表明出土树脂制品使用的原料是柯巴或地质年代较近的树脂。
热裂解处理时会将大分子有机物瞬间裂解为小分子基团，同一化合物的裂解位置和碎片数量并不固定，仅可根据裂解规律还原原分子结构，因此该方法存在一定误差[52]。裂解产物的组成和分布强烈依赖于裂解温度，裂解温度是热裂解前处理中最关键的实验参数。若温度过低，裂解速度慢，特征碎片产率低；若温度过高，低碳数非特征碎片增多，原结构还原困难。如图 8所示，缅甸金珀在520 ℃裂解时，在Py-GC/MS测试中产生的保留时间短，分子量低的碎片远比420 ℃裂解时的多，这对于原结构推导造成很大阻碍。因此，在选择样品热裂解温度时，建议选择能够使高分子发生裂解的较低温度，以尽可能保留原结构的大分子碎片。此外，热裂解后的碎片结构和数量受样品性质、裂解温度、裂解时间影响较大，实验重复性相对较差，对于需要准确定量的物质较不适用。
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图 8 缅甸金珀在420 ℃和520 ℃裂解温度时的热裂解-气相色谱-质谱图Figure 8. Py-GC-MS of golden amber from Myanmar at pyrolysis temperatures of 420 ℃ and 520 ℃5. 固相微萃取-气相色谱-质谱在琥珀成分分析中的应用
固相微萃取(Solid Phase Microextraction，SPME)是以涂在纤维(一般是石英玻璃纤维)上的固定相(高分子涂层或吸附剂)作为吸附介质，对样品中目标组分进行选择性吸附后，在GC进样口中热解吸进样进行测定的方法[53]，其原理图如图 9。该类型前处理中顶空固相微萃取(Head Space Solid Phase Microextraction, HS-SPME) 对挥发性成分的分析更快、更方便，也在琥珀成分分析中最常使用。顶空是进样方式，将待测样本置于一恒温密闭容器中，通过加热使得挥发性组分从样本中挥发出来，在顶空瓶里面的气固两相中达到热力学平衡之后，直接抽提顶部气体打入气相色谱质谱仪器中进行分离分析，从而进行挥发性或半挥发性物质的检测[54]。
笔者及其团队前期基于固相微萃取技术的琥珀挥发性有机物/半挥发性有机物成分检测方法(图 10)，并且对比直接脱附和顶空高容量固相微萃取两种分析方法，直接脱附方法，可以采集到更多低沸点易挥发的化合物(图 11蓝框处)，顶空高容量固相萃取，对于高沸点，半挥发性化合物，得到更好的灵敏度(图 11红框处)，后续的实验中为获取更多的多环芳烃(高沸点、半挥发)采用顶空固相微萃取方法。
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图 10 基于固相微萃取技术的琥珀挥发性有机物/半挥发性有机物成分检测Figure 10. Detection of amber volatile organic compounds/semi volatile organic compounds based on solid phase microextraction technology![]()
图 11 顶空高容量固相萃取对于高沸点，半挥发性化合物的灵敏度更好Figure 11. Headspace high volume solid phase extraction is more sensitive to high boiling point and semi volatile compounds虽然琥珀中低分子量的挥发份和半挥发份非常少(5%)，但是其中可含有指示琥珀古植物源的醇类、茚类重要生物标志物。因此，固相微萃取前处理对于琥珀的古植物溯源相关分析有重要意义。McCoy等[38]采用SPME-GC-MS对中新世-全新世的美洲和非洲琥珀、柯巴和现代树脂的挥发性和半挥发性成分进行了分析，通过计算特定挥发份的相对丰度，结合主成分分析，实现了产地和地质年代的分类，分析了其中植物分泌的具有昆虫防御作用的特定化学成分，结合树脂化石中保存的食草昆虫遗体，论述了该时期植物-昆虫的相互作用。McCoy等[39]采用相似的分析方法将研究范围进一步扩大到了多个不同产地的白垩纪琥珀、柯巴和树脂，结果表明，白垩纪时期琥珀的主成分区分度更高，也意味着其来自于更广泛的古植物来源。
由于顶空固相微萃取的加热温度低，且灵敏度高，因此小块状琥珀样品可直接放入顶空瓶中加热且外观无明显变化，实现挥发份/半挥发份的近于无损分析，这对于珍贵琥珀文物的成分分析十分有利。而挥发份/半挥发份与古植物源紧密相关，因此，该方法也适用于琥珀的产地溯源及琥珀近似物的鉴别。Werf等[37]采用HS-SPME-GC-MS对波罗的海和罗马尼亚琥珀进行分析发现，虽然这两种类型的琥珀的化学成分近似，但在筛选了多种相对丰度不同的分子联合多元统计分析后实现了产地区分。
SPME是一种简单快速、无溶剂、高富集效率的前处理方法，可高效准确地解析琥珀中的小分子物质，避免溶剂或二次产物带来的干扰，和气相色谱-质谱(GC-MS)联用可以实现挥发份/半挥发份的定性定量分析。然而，SPME的萃取头涂层的极性与厚度须与待测物的性质相匹配，如极性强的涂层如聚丙烯酸酯(PA)适用于萃取极性化合物，而非极性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)涂层则主要用于非极性化合物的萃取。如果使用的不当萃取头，将导致目标化合物无法萃取的结果。HS-SPME还需在在GC分析之前对蒸汽提取物进行再浓缩，若分析物易挥发则通常通过吸附剂或冷阱或结合两者来完成，该过程易发生低浓度的化合物逸散而无法检测。此外，在较高的萃取温度下，热稳定性较低的分析物可能结构改变而导致定量不准确。结合顶空高容量固相萃取法和直接热脱附法样品前处理技术和全二维气相色谱-质谱技术，并可检测到传统分析方法3~4倍的化合物种类数量，并通过非靶向代谢组学策略分析不同产地树脂化石色谱质谱结果，可筛查出更具代表性的特征化学信息，研究复杂有机组分的分离、同分异构物的准确判别。
6. 树脂化石在古生态环境的反演中的作用
树脂化石中的生物标志物是判断树脂化石的古植物源的重要证据，也是反映远古时期生态环境变化的重要依据。现代的产树脂植物包括松柏类的裸子植物和诸多被子植物科，古代的产树脂植物还包括绝灭的、曾经繁盛于石炭-二叠纪的科达类和髓木类种子蕨以及石炭纪以来出现并己绝灭的一些松柏类裸子植物，了解这些植物的变迁过程有赖于对树脂化石和现代树脂间的生物标志物的充分探讨。来自中国科学院南京地质古生物研究所的科研人员联合国外学者采用色谱-质谱等生物标志物分析方法，认为中国漳浦琥珀来源于热带被子植物中的龙脑香科植物[55]。然而，传统选择含量最丰富的生物标志物作为研究对象可能存在一定局限性，该方法常出现生物标志物对树脂的特异性低，抗老化性差的问题，因此，少量的特定分子/分子组合(无法仅从视觉上筛查出)可能有助于更完整地解释其与古植物间的联系[56]。非靶向代谢组学方法可以全方位准确地识别不同产地树脂化石中的检出成分，所筛选的生物标志物与受古植物属种和古环境影响的琥珀成分变化紧密相关。Decq L等[28]利用热辅助水解甲基化气相色谱质谱(THM-GC/MS)对文物上的油漆、清漆和多个产地的柯巴树脂进行了分析，采取非靶向代谢组学的方法成功找到了其中具有特异性的生物标志物，并揭示了文物上的油漆、清漆的原料来源。然而，非靶向代谢组学用于树脂化石的研究仍处于初始阶段，这一强有力的计量学研究方法如何有效解决树脂化石中的重要科学问题仍有待学界进一步探讨。
树脂是植物响应外界环境和内部生物刺激而分泌的萜类和酚类次生代谢产物[57]，其成分除了与植物种有关，也与树脂分泌的原因有关。R.C.McKellar等[58]对比了琥珀和现代树脂中13C的富集情况，发现多米尼加中新世琥珀和新泽西晚白垩纪琥珀中的13C值与现代受到昆虫攻击的树脂中的13C值相似，13C富集情况可作为现代和古代森林生态系统中生态压力的敏感监测指标。M.Najarro等[59]对西班牙北部的早白垩世琥珀沉积地层进行了分析，发现了大量的木炭与琥珀相结合，证明古火很可能促进了树脂的产生，随后形成了琥珀富集区域。因此，树脂化石是记录古地理环境及区域地质变化信息重要的窗口，联立成分解析新方法及谱学检测技术可望从表象及本质两个维度作为全面认识树脂化石的突破口，深入探讨其记录的地球化学信息，为揭示高等植物地质演化过程及指示古生态环境变化提供科学依据。然而古生态环境变化正如蝴蝶效应一般，不能将其割裂来研究，因此，世界各地不同年代、品种的树脂化石数据库的建立成为了多维度古生态环境系统研究的有力途径。
综上所述，树脂化石由复杂有机组分构成，其有效的分离和结果的准确定性成为了有待解决的难题。此外，新兴化学分析方法为我们揭示树脂化石的复杂有机组分提供了可能，但如何有效解析这些庞杂的数据结果也是学界的关注点。学者们采用的色谱-质谱技术、光谱技术和波谱技术都在树脂化石研究中发挥了重要作用，但各种方法各具所长，前期对于三者结果缺乏彼此间的交叉探讨，未来通过跨学科交叉合作将推动树脂化石研究在分析化学、地球化学、宝石学方面的发展，共同探讨并验证高灵敏度高通量高准确性的检测和解析技术在树脂化石成分结构中的应用及案例示范，进一步建立有机地球化学解析与检测的前沿研究合作，并利用不同领域合作伙伴关系来应对树脂化石复杂成分的处理、分离与鉴定方法问题，建立合作联系，共同推进基础研究与创新应用，包括样品前处理技术(Sample Pretreatment Technology)-谱学检测方法(Spectroscopy Detection Methods)-代谢组学分析(Metabolomics Analysis)-数据库建设(Database Construction)。
7. 结语
树脂化石作为大分子复杂成分有机物，对其进行适宜的前处理，以实现其化学组分中复杂物质的萃取分离及加强琥珀化学成分的检测灵敏度及结构准确性，并减少后续气相/液相色谱质谱分析的困难度。针对不同的树脂化石化学分析目的，需采取匹配的前处理方法。虽然目前尚未存在一种通用于各类琥珀的前处理方案，但分子结构中活泼氢的基团衍生化反应和低浓度组分的再次富集，往往是有效分离组分，增强检测能力的方法。
本文研究针对树脂化石的化学成分分析中的4种有效前处理方法(溶剂萃取、化学衍生化、热裂解、固相微萃取)展开了特点、适用范围、优缺点的探讨。其中，溶剂萃取主要适用于形成年代较近的琥珀，即含可溶性萜类、酚类、烃类等含量较多的化合物。石化程度高、年代久的琥珀不能完全溶解且溶解时间长，不适用此方法；化学衍生化法一般与热裂解或气相色谱等方法联用，特别适用于分析基团中有活泼氢的分子，衍生化后可有效改善相关分子的挥发性、稳定性和增强响应信号强度；热裂解主要针对琥珀中的有机聚合物的主要骨架，能够有效解读大分子骨架的信息；固相微萃取则适用于琥珀中的挥发份/半挥发份的分析，主要用于研究与古植物源有关的低分子量分子。热裂解前处理和近于无损的固相微萃取适合用于珍贵出土琥珀文物的研究，结合多元统计方法可有效解决考古界较为关心的出土琥珀产源问题。目前仅有热裂解一种方法可以分析琥珀中占主体结构的大分子聚合物，然而由于裂解过程中生成碎片的复杂性，前人的研究仅仅解释了某种类琥珀中的局部骨架结构，对于琥珀的主体骨架结构仍有待进一步的探究。需要充分发挥前处理技术的优势，以求对琥珀复杂的化学成分进行有效的分离和灵敏精确检测分析。未来从高灵敏度高精度化学分析方法作为全面认识琥珀的突破口，深入探讨其记录的地球化学信息，有望进一步揭示高等植物地质演化过程及古环境气候变化情况。
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图 1 Ⅰ型树脂化石的基本结构及其单体结构示意图[9]
Figure 1. The basic structure of ClassⅠ resinites and its monomeric structure
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图 2 树脂化石化学分析流程和常见的前处理方法
Figure 2. The chemical analytical workflow and common pretreatment methods for resinites
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图 3 样品制备与组分分离的基础步骤
Figure 3. Basic steps in sample preparation and component separation
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图 4 缅甸琥珀(a)和多米尼加琥珀(b)的高效液相色谱-紫外检测结果
Figure 4. HPLC chromatograms of amber from Myanmar (a) and amber from Dominican Republic (b)
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图 5 化学衍生化法分离组分的步骤
Figure 5. Steps for the separation of components by chemical derivatization
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图 6 相对于TMAH甲基化反应，HMDS硅烷化反应具有更高的灵敏度和最佳峰值分辨率[21]
Figure 6. The higher sensitivity and a best resolution of peaks achieved from the derivatization with HMDS, compared to the TMAH methylation reaction
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图 8 缅甸金珀在420 ℃和520 ℃裂解温度时的热裂解-气相色谱-质谱图
Figure 8. Py-GC-MS of golden amber from Myanmar at pyrolysis temperatures of 420 ℃ and 520 ℃
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图 10 基于固相微萃取技术的琥珀挥发性有机物/半挥发性有机物成分检测
Figure 10. Detection of amber volatile organic compounds/semi volatile organic compounds based on solid phase microextraction technology
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图 11 顶空高容量固相萃取对于高沸点，半挥发性化合物的灵敏度更好
Figure 11. Headspace high volume solid phase extraction is more sensitive to high boiling point and semi volatile compounds
表 2 琥珀与不同溶剂(含化学式)的反应时间和效果[41]
Table 2 Chemical reaction of the amber to different solvents, their chemical formula, and the duration of the reaction[9]
溶剂 化学式 时间 效果 Acetone C3H6O ∞ 在丙酮中浸泡了几天后，琥珀仅有表面受到了影响，琥珀样品变得很脆且碎 Dichlormethane CH2Cl2 ~1 h 琥珀在二氯甲烷中快速溶解了，但溶剂对包裹体是否有影响还未进行检测 Trichlormethane CHCl3 ~0.5 h 琥珀快速地褪色并且溶解，并且琥珀内部的包裹体脱水 Dimethylformamide HCO-N(CH3)2 ∞ 琥珀样品仅漂浮在溶剂表面，几周后都没有变化 Formaldehyde CH2O ∞ 琥珀样品仅漂浮在溶剂表面，几周后都没有变化 Petroleum ether CnH2n+2(n=5~8) ∞ 石油醚具有多个闪点，使琥珀具有弹性且变得不透明; 此外，石油醚还浸渍了样品, 琥珀开始产生线状条纹; 几个小时后，浸泡在石油醚中的琥珀变成了泥土状、粘稠的混合物 Turpentine oil predominantly C10H16 (α-Pinen) ~2 d 溶解琥珀的时间最长，但溶解的效果很好; 溶剂对包裹体是否有影响还未进行检测 Orange oil predominantly C10H16 (d-limonene) 3~4 h 溶解琥珀的能力很强，至今为止没有发现橙油会损坏包裹体 Toluene C6H5CH3 ~1 h 溶解琥珀的能力很强，与少量的乙醇混合时效果最好；包裹体残留在溶剂中时会脱水 Xylene C6H4(CH3)2 ~1 h 比甲苯溶解琥珀的效果更强; 溶剂对包裹体是否有影响还未进行检测 
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